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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 10977 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Wir untersuchten die antikariogene Wirkung einer experimentellen synbiotischen Verbindung, die Geleebonbons auf der Basis von probiotischem Lacticaseibacillus rhamnosus (NRRL B-442), ergänzt mit natürlichem präbiotischem Traubenkernextrakt (GSE), in einer Nanoemulsionsformel enthielt, auf die Kolonisierung und Etablierung von Streptococcus mutans (ATCC). 25175) und Actinomyces viscosus (ATTCC 19246) Biofilme durch Zählen koloniebildender Einheiten, Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Anschließend analysierten wir die remineralisierende Wirkung synbiotischer Geleebonbons auf Oberflächenläsionen des menschlichen Zahnschmelzes mithilfe von Vickers-Mikrohärtetestern, Rasterkraftmikroskopie (AFM), SEM, energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDAX) und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM). drei Stufen (gesund, nach Demineralisierung und nach pH-Zyklus). Nach 21-tägiger Behandlung der pH-geregelten Schmelzscheiben mit Geleebonbons für 10 Minuten zweimal täglich stellten wir fest, dass die Bildung von S. mutans-Kolonie um 68 % zurückging, die Biofilmentwicklung reduziert wurde und S. mutans, das in Geleebonbons bei der REM-Untersuchung sichtbar gemacht wurde, eingefangen wurde. und die morphologische Struktur dieser Bakterien unter TEM-Analyse erheblich verändert. Bei Remineralisierungsmessungen wurden statistisch signifikante Unterschiede in der Mikrohärte, dem integrierten Mineralverlust und der Läsionstiefe durch CLSM zwischen Demineralisierungs- und Behandlungsstadium festgestellt. Diese Ergebnisse liefern eine wirksame antikariogene synbiotische Verbindung aus Traubenkernextrakt und probiotischem Geleebonbon mit potenzieller remineralisierender Aktivität.

Zahnkaries ist eine endogene Infektion, die aus einer Mikrobiom-Dysbiose resultiert, an der säurebildende und saure Arten beteiligt sind, zu denen Nicht-Mutans-Streptokokken mit niedrigem pH-Wert, Mutans-Streptokokken (MS) und zahlreiche Actinomyces-Arten gehören, die einen selektiven ökologischen Vorteil gegenüber anderen Arten erzielen1. Moderne Paradigmen der Zahnkaries-Ätiologie konzentrieren sich auf den großen ökologischen Druck und das Mikrobiom des Zahnbelags, der diesen so modulieren kann, dass er Krankheiten verursacht. Es wird auch die wesentliche Rolle erkannt, die eine Mikrobiom-Symbiose von Zahnbelag bei der Vorbeugung von Karies und der Verbesserung der Mundgesundheit spielt. Basierend auf diesen Prinzipien wurden zahlreiche ökologische Präventionsstrategien entwickelt, die das Arsenal der derzeit verfügbaren Kariespräventionsmaßnahmen wahrscheinlich erweitern könnten2. Chlorhexidin scheint aufgrund seiner substantiellen Wirkung und übermäßigen antimikrobiellen Aktivität das Goldstandard-Antiplaque-Mittel zu sein3. Bedauerlicherweise kann eine längere Exposition gegenüber therapeutischen Wirkstoffen zu Nebenwirkungen führen, vor allem zu einem Ungleichgewicht im Mundmilieu, das durch ihre bakteriziden Eigenschaften ausgelöst wird. Aus diesem Grund werden Antiplaque-Mittel mit sehr geringer direkter bakterizider Wirkung gesucht4.

Es wurden mehrere Strategien vorgeschlagen, um die kariogene Plaque-Mikrobiom-Dysbiose wieder ins Gleichgewicht zu bringen, basierend auf Probiotika unter Verwendung verschiedener Lactobacilli-Arten, darunter L. rhamnosus GG, L. casei, L. reuteri und Bifidobacterium spp., die die Aktivität odontopathogener Bakterien vermitteln und das Wachstum behindern von Krankheitserregern durch die Produktion mehrerer antimikrobieller Wirkstoffe5,6. Eine moderne Studie bestätigte, dass eine kurzzeitige Fluoridexposition im Rahmen von Mundhygienemaßnahmen die säurehemmende Wirkung nicht aufrechterhalten kann, da die Biofilme mit der Zeit ohne Berücksichtigung der Fluoridkonzentration wieder azidogen werden.7 Eine Fluoridtherapie allein ist bei hohen Kariesproblemen nicht ausreichend8,9. In dieser Hinsicht könnte es ein neuer Ansatz sein, über eine biomimetische Methode nachzudenken, bei der selektive natürliche Wirkstoffe mit hoher intraoraler Retention und Remineralisierung ohne nennenswerte Nebenwirkungen zum Einsatz kommen. Studien haben gezeigt, dass Traubenkernextrakt (GSE) die Remineralisierung kariöser Läsionen verbessern kann und sich offenbar von der Wirkung von Fluorid unterscheidet10,11. Darüber hinaus ermöglicht Gallussäure, ein Hauptbestandteil von GSE, die Ablagerung von Mineralien9. Glücklicherweise gilt Traubenkern-Proanthocyanin-Extrakt aufgrund seiner selektiven Eigenschaften bei der Stimulierung der probiotischen Mikrobiota und der Hemmung des Wachstums und der Aktivität pathogener Bakterien als präbiotisches Mittel12. Probiotika-GSE-Aggregate können daher als „symbiotisch“ bezeichnet werden, da sie auf einen Synergismus hinweisen, bei dem die präbiotische Verbindung die probiotische Verbindung selektiv bevorzugt13.

Es wurde festgestellt, dass Geleebonbons ein hervorragendes Vehikel für den Transport dieser letztgenannten symbiotischen Verbindung zum Mund sind, da angenommen wird, dass das Probiotikum Traubenkernextrakt auf diese Weise über einen längeren Zeitraum der Zahnoberfläche und in der Mundhöhle ausgesetzt werden könnte für wohltuende Wirkungen. Darüber hinaus steigert der Kaustoß selbst die Speichelstimulation und verbessert das Bikarbonat-Puffersystem des Speichels13. Basierend auf diesen Überlegungen besteht das Ziel unserer Studie zunächst darin, die Antibiofilmwirkungen probiotischer Traubenkerngeleebonbons auf die Lebensfähigkeit der Kolonisierung von Streptococcus mutans und Actinomyces viscosus auf Zahnschmelzoberflächen im Labor zu analysieren und anschließend die morphologischen Aspekte mithilfe von Raster- und Transmissionselektronen zu visualisieren Mikroskopie. Zweitens dient es der quantitativen Analyse der Mikrohärte, der energiedispersiven Röntgenspektroskopie (EDAX) sowie der durchschnittlichen Fluoreszenz sowohl der demineralisierten als auch der remineralisierten Zonen der kariösen Läsionen im Labor, die diesem Gummibärchen unter einem konfokalen Laserscan ausgesetzt wurden Mikroskop.

Hier gehen wir davon aus, dass ein experimentelles symbiotisches Geleebonbon Biofilme modifizieren und die Belastung durch kariogene Bakterien verringern könnte, um das Wachstum und die Dominanz gesunder Bakterien im Mikrobiom des Zahnbelags zu fördern.

Die roten Traubenkerne der Vitis vinifera (Syrah-Traube) wurden als Produktionsbeutel vom Herstellerwerk Ganklees (Gouvernement Alexandria, Ägypten) erhalten. Die Extraktion roter Traubenkerne wurde in der Abteilung für Verpackungsmaterialien des Chemical Industrial Research Institute (Nationales Forschungszentrum, Ägypten) vorbereitet. Die in dieser Studie verwendete Extraktionsmethode ähnelte der von El-Sayed et al.14 erläuterten Methode. 200 g Traubenkernpulver wurden mit einer Waage (Pyrometro, Malaysia) mit 800 ml ethanolischem Lösungsmittel in einem Kolben (Ethanol:Wasser, 70:30 (v/v)) unter ständigem Rühren in einem Rotationsschüttler (Certomat Model S) extrahiert II, Sartorius, Göttingen, Deutschland) bei 200 U/min, 45 °C, für 2 Stunden. Dies wurde später zentrifugiert (Eppendorf Modell 5810 R, Hamburg, Deutschland) bei 5000 U/min für 10 Minuten und anschließend dekantiert. Anschließend wurde der Rückstand erneut dekantiert -2 Stunden lang extrahiert, und die Überstände wurden unter Verwendung eines Rotationsverdampfungsgeräts (Büchi Rotavapor R-215, Flawil, Schweiz) bei einem eingestellten Druck von 175 mBar, einer Temperatur von 52 °C und einer Geschwindigkeit von 95 U/min eingedampft, um das Lösungsmittel zu entfernen . Der ethanolische Extrakt aus Traubenkernpulver wurde gesammelt und in einem Glasbehälter unter gefrorenen Bedingungen gelagert14. Der ausgewählte probiotische Stamm Lacticaseibacillus rhamnosus (NRRL B-442) wurde vom Dairy Microbiology Laboratory (Food Industries and Nutrition Research Institute, National Research Center) bereitgestellt , Ägypten) und wuchs in MRS-Brühe und wurde 48 Stunden lang bei 37 °C anaerob inkubiert. Die Bakterienzellen wurden nach 15-minütiger Zentrifugation bei 5000 U/min unter Verwendung einer Kühlzentrifuge bei 4 °C14 gewonnen. Die erhaltenen Zellen wurden mit Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) gewaschen und unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. GSE-Nano-Emulsion mit einer Konzentration von 3 % mit gewonnenen probiotischen Zellen in einer Anzahl von etwa 107 KBE/ml, eingearbeitet in eine vorbereitete Geleebonbon-Basisformel (unter Patentregistrierung Nr. 2021/976; Ministerium für wissenschaftliche Forschung, Akademie für wissenschaftliche Forschung und Technologie, Ägypten) . GSE-Nanoemulsion mit einer Konzentration von 3 % mit gewonnenen probiotischen Zellen in einer Anzahl von etwa 107 KBE/ml, eingearbeitet in eine vorbereitete Geleebonbon-Basisformel. Zunächst wurden probiotische Geleebonbons hergestellt, indem Wasser mit Honig erhitzt und in einer Messingpfanne gut vermischt wurde. Anschließend die Gelierlösung durch Schmelzen der Gelatine in warmem Wasser bei 70 °C zum zuvor zubereiteten Sirup geben und gut vermischen. Die in Tween® 80 enthaltene Ölsäure wurde hinzugefügt, als die Temperatur 90 °C erreichte. Die Temperatur der Mischung sank auf 40 °C, bevor die zuvor entwickelte Formel hinzugefügt wurde, die von probiotischen Zellen von L. rhamnosus mit 3 % GSE-Nanoemulsion bestimmt wurde14. Die morphologische Untersuchung der mit Nanoemulsions-Traubenkernextrakt (GSE) ergänzten probiotischen Geleebonbons wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ausgewertet (Abb. 1).

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigt einen Teil eines Geleebonbons mit probiotischen Bakterien (schwarzer Kreis) im Inneren.

Unstimulierter Speichel stammte von gesunden weiblichen erwachsenen Freiwilligen (im Alter von 18–25 Jahren), die seit mindestens 6 Monaten keine Antibiotikatherapie erhalten hatten. Die Freiwilligen hatten mindestens anderthalb Stunden lang auf Essen, Trinken und Zähneputzen verzichtet. Speichelproben wurden in sterilen Röhrchen gepoolt und 30 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min zentrifugiert. Die Pasteurisierung der Überstände wurde 30 Minuten lang bei 65 °C durchgeführt, gefolgt von Zentrifugation und Dispergierung des Überstands in sterilen 50-ml-Polypropylenröhrchen, die schließlich bei –20 °C gelagert wurden15,16. Die Wirksamkeit der Pasteurisierung wurde durch Inkubation von 100 µl verarbeiteter Speichelproben auf Columbia-Blut-Agarplatten abgeschätzt und die Abwesenheit von KBE (d. h. die Nachweisgrenze von 10 KBE/ml) wurde nach 72 Stunden bei 37 °C entweder aerob oder bestimmt anaerob inkubierte Platten.

Insgesamt wurden 140 menschliche Zahnscheiben für mikrobiologische und Remineralisierungstests ausgewählt. Insgesamt wurden 140 menschliche Zahnscheiben für mikrobiologische und Remineralisierungstests ausgewählt. Aus extrahierten menschlichen Seitenzähnen (extrahiert aus nicht kariesassoziierten kieferorthopädischen und therapeutischen Gründen) wurden Schmelzscheiben mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Dicke von 2 mm gewonnen. Ein zylindrischer diamantbeschichteter Bohrer (Trephine) wurde senkrecht zur bukkalen Oberfläche der aktuell extrahierten Zähne verwendet, und die Schmelzoberflächen wurden mit Siliziumkarbidpapieren der Körnung 600/800/1200/1500/2000 nass geschliffen17. Neunzig Scheiben für die mikrobiologische Bewertung wurden für die Zählung der Lebensfähigkeit von Bakterien, das Screening der Biofilmbesiedlung mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) indiziert. Diese Scheiben wurden an den Seiten und an der Unterseite mit Nagellack geschützt, sodass die bukkale Schmelzoberfläche am effektivsten frei blieb, und mit einem aus kieferorthopädischem Draht präparierten Halter fixiert, der während der gesamten Versuchsdurchführung in vertikaler Position gelagert wurde.

Die in dieser Studie untersuchten Mikroorganismen waren Streptococcus mutans (ATCC 25175) und Actinomyces viscosus (ATCC 19246). Alle Stämme wurden von MIRCEN (Microbiological Resources Centre, Kairo, Ägypten) erhalten und bei –80 ° C kryokonserviert. Vor jedem Experiment wurden zwei Subkulturen in tryptischer Sojabrühe (Difco, Sparks, MD, USA) für Actinomyces und Streptococcus hergestellt. Für Lacticaseibacillus rhamnosus (NRRL B-442) wurde MRS-Medium (Merck, Darmstadt, Deutschland) verwendet und alle wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.

Das Versionssystem des bakteriellen oralen Biofilms wurde gemäß der von Guggenheim et al.18 entwickelten Version getestet, mit einigen Anpassungen, wie zuvor beschrieben19. Um die Bildung eines Speichelhäutchens zu ermöglichen, wurden neunzig zuvor präparierte Schmelzscheiben zufällig in einer sterilen Polystyrol-Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen (Nunc A/S, Roskilde, Dänemark) angeordnet und 4 Stunden lang mit pasteurisiertem Speichel (800 µl) inkubiert , vorsichtig geschüttelt (Eberbachs Microplate Vortex Laboratory Shaker E6120, USA) und bei Raumtemperatur aufbewahrt18. Anschließend wurde Speichel aus jeder Vertiefung abgesaugt und durch ein Biofilm-Wachstumsmedium ersetzt, das eine Mischung aus 800 µl pasteurisiertem Speichel, 21 Aminosäuren (insgesamt 2,6 g/l), Vitaminen, Nukleotiden, anorganischen Salzen, Spurenelementen und 10 mM Glucose enthielt und 200 µl bakterielles Inokulum. Darüber hinaus unterstützte das vorherige Medium das Wachstum von Actinomyces- und Streptococcus-Arten, wurde mit 800 µl flüssigem Universalmedium (FUM) ergänzt, enthielt 67 mmol/l Sorensen-Puffer, pH 7,2, und war mit 0,15 % Saccharose und 0,15 % Glucose angereichert18. Für die bakterielle Inokulumvorbereitung wurde eine Kombination von 1 ml Übernacht-Vorkulturen (OD550 nm = 1,0 ± 0,02) jedes der beiden Stämme (S. mutans, A. viscosus) durchgeführt.

Das Inokulum enthielt reproduzierbar zwischen 107 und 108 KBE jeder Art pro ml (Mischkulturen von A. viscosus und S. mutans wurden durch Mischen gleicher Volumina reiner Kulturen erhalten). Das Biofilmwachstum unter fakultativ anaeroben Bedingungen wurde durch Mischen von (95 % N2 + 5 % CO2) mit (75 % N2 + 5 % CO2 + 20 % O2) (Anaerobic Chamber (Anaerobic Workstation), ICB-AN3P, Bioevopeak, China) erreicht. bis zu 10 Tage bei 37 °C20. Neunzig Schmelzscheiben wurden nach dem Zufallsprinzip in drei Hauptgruppen (n = 30) eingeteilt, entsprechend dem Behandlungsmittel, das der Biofilm-Kontrollgruppe (G1) ohne Behandlung, der sterilen Kochsalzlösungsgruppe (G2) und der Versuchsgruppe (G3) ausgesetzt war. Für die Versuchsgruppe wurden die Emaillescheiben zweimal täglich für 10 Minuten in 2 ml Lösung von 50 µg probiotischem GSE-Geleebonbon mit destilliertem Wasser eingetaucht21. Die Scheiben wurden 10 Sekunden lang in steriler Kochsalzlösung getaucht und anschließend in ihren Vertiefungen ausgetauscht. Bei jeder Exposition wurde die Platte anaerob bei 37 °C inkubiert und das Inkubationsmedium wurde in allen Experimenten täglich gewechselt. Vor dem Austausch des Mediums wurden die Platten leicht geschüttelt, die Scheiben 10 Sekunden lang in steriler Kochsalzlösung getaucht und auf eine neue Platte übertragen, auf der das frische Medium abgegeben wurde. Nachdem die letzte Behandlung am einundzwanzigsten Tag erfolgte, wurden die dreißig Schmelzscheiben jeder Gruppe in Mikroröhrchen gelagert, wobei jedes Mikroröhrchen zehn Proben enthielt und 48 Stunden lang bei 37 °C in einer Atmosphäre aus 95 % N2 + 5 inkubiert wurde % CO2 bis zur Verwendung für Testverfahren.

Die zehn Schmelzscheiben jeder Gruppe wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in eine sterile Petrischale aus Kunststoff gelegt, und ihre Oberfläche wurde mit einer sterilen Zahnwurzelkürette abgeschabt. Anschließend wurden die Oberfläche der abgeschabten Scheibe und der Petrischale mit 1 ml physiologischer Kochsalzlösung gespült. Aliquots des geernteten Biofilms wurden verdünnt und spiralförmig auf das selektive Medium für jeden Stamm aufgetragen: Mitis Salivarius-Agar + Tellurit (Difco, Sparks, MD, USA) für S. mutans und Trypticase-Soja-Agar (Difco) für A. viscosus , alles in 48–72 Stunden Inkubation bei 37 °C. Die CFU wurden für die Biofilm-wachsende Gruppe (G1; BG), in der Biofilme aus Speichel initiiert und herangewachsen wurden, für die Probiotika-GSE-Jelly-Candy-Behandlungsgruppe (G2; TG) und die sterile Kochsalzlösungs-Kontrollgruppe (G3; CG) durchgeführt ). Die KBE pro Population für dreifache Scheiben wurden gemittelt und einer logarithmischen Transformation unterzogen.

Die zehn ausgewählten Proben jeder Gruppe wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie (High-Resolution Quanta FEG 250-SEM, Tschechische Republik) untersucht. Die Proben wurden 24 Stunden lang in einer 2,5 %igen Glutaraldehydlösung fixiert, mit 0,1 M Na-Acetatpuffer gespült und mit einer abgestuften Ethanolreihe dehydriert. Schließlich wurden sie getrocknet, einem kritischen Punkttrockner (Baltec, Leica Microsystems, Milton Keynes, UK) mit CO2 ausgesetzt und mit einer Polaron SEM-Beschichtungseinheit22 mit Gold von 15 nm Dicke durch Sputtern beschichtet.

Für die TEM wurden die letzten zehn Proben jeder Gruppe 30 Minuten lang in ein Fixiermittel getaucht, das 2,5 % Glutaraldehyd und 1,5 % Paraformaldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,4) enthielt. Nach dreimaligem Waschen mit 0,1 M Cacodylatpuffer und einstündiger Nachfixierung mit Osmiumtetroxid wurde eine Dehydratisierung in einer aufsteigenden Ethanolreihe mit Nachfärbung in Uranylacetat durchgeführt. Anschließend wurden alle Proben beider Gruppen zum Querschneiden der anhaftenden Biofilme mit einem Leica Ultracut E (Leica, Wetzlar, Deutschland) montiert. In jedem ultradünnen Schnitt (60 nm Dicke), der auf gefilmten Cu-Gittern montiert und mit Bleicitrat nachgefärbt wurde, wurde die gesamte Länge des Biofilms hinsichtlich seiner Ultrastruktur in einem TEM (EM 900, Zeiss, Oberkochen, Deutschland) bei 80 °C untersucht kV und Vergrößerungen von 3000 × bis 20.000 ×23,24.

Fünfzig Schmelzscheiben, die für Remineralisierungsmessungen in drei Phasen (Schall, nach Demineralisierung und nach pH-Zyklus) verwendet wurden, wurden mit Nagellack bedeckt, so dass auf der bukkalen Oberfläche ein Fenster von 3 × 3 mm verblieb. Für den Vickers-Mikrohärteprüfer wurden zwanzig Scheiben getestet, während die gleichen zehn Scheiben für SEM, energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDEX) (gemessene Elemente: Ca, P, F, C, Mg, N) und Atome verwendet wurden Kraftmikroskopie (AFM). Für das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) wurden zwanzig Scheiben für die lineare Tiefe des induzierten remineralisierten Bereichs verwendet. Auf der Klangbühne wurden die Schallplatten nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und die Ausgangswerte für jeden Test gemessen25. Nach der Messung der einwandfreien Emaillescheiben wurden die Emaillescheiben 96 Stunden lang in ca. 40 ml Entmineralisierungslösung (0,1 M Milchsäure, 4,1 mM Ca (CaCl2 × 2H2O), 8,0 mM PO4 (KH2PO4) pro Emaillescheibe bei pH 4,6 aufbewahrt steriles Becherglas bei 37 °C26. Zusätzlich wurden der Entmineralisierungslösung 0,2 % w/v Carbopol 907 (C907; BF Goodrich, Cleveland, OH, USA), ein synthetisches Polymer mit hohem Molekulargewicht, als Oberflächenschutzmittel zugesetzt Erhalten Sie die Zahnschmelzoberfläche und helfen Sie bei der Entstehung von darunter liegenden Läsionen27.

Insgesamt 20 Emaillescheiben wurden auf einem Acrylharzblock eingebettet und zur Analyse der Oberflächenhärte mit einem Vickers-Mikrohärtetester (Shimadzu HMV-M Micro-hardness Tester; Newage Testing Instruments Inc., Southampton, PA, USA) unter einer Last von 200 g verwendet und eine Verweilzeit von 15 s28,29. Die Mittelwerte der gemessenen Vickers-Härtezahl (VHN) von drei Vertiefungen wurden zu Studienbeginn vor der Zahnschmelzbehandlung und nach der Demineralisierung ermittelt30. Anschließend erhielten die Zahnschmelzscheiben eine Remineralisierungsbehandlung, indem sie 15 Tage lang zweimal täglich für 5 Minuten einer Lösung ausgesetzt wurden, die 5 g Geleebonbons auf Probiotika-GSE-Nanoemulsionsbasis enthielt, gelöst in 2 ml Speichel (zuvor während der mikrobiologischen Untersuchung zubereitet)31. Nach jeder Exposition wurden die Proben 20 Sekunden lang mit destilliertem Wasser gewaschen und dann bis zur nächsten Teststufe in die Speichellösung mit einem pH-Wert von 7,1 bei Raumtemperatur eingetaucht. Die Speichellösung wurde alle 24 Stunden und 32 Minuten aufgefüllt. In der Zwischenzeit wurden die behandelten Schmelzzahnproben am 7. Tag und am Ende des 15. Tages auf ihre Oberflächenhärte untersucht. Die Ergebnisse werden als Mittelwert und Standardabweichung der VHN-Werte zu Studienbeginn, der Demineralisierung und der Remineralisierung am 7. und 15. Tag ausgedrückt. 34.

Die morphologische Analyse von zehn Proben wurde mit einem REM (Quanta 250 Field Emission Gun) durchgeführt, das an ein EDAX-Gerät (Energy Dispersive X-Ray Analyses) angeschlossen war und mit einer Beschleunigungsspannung von 30 kV betrieben wurde. Die Emailscheiben wurden zunächst in einem Vakuumverdampfer (MED 010; Balzers, Balzers, Liechtenstein) durch Sputtern mit Gold bedeckt und anschließend mikroskopisch analysiert, um Mikroaufnahmen der Oberflächenmorphologie der behandelten Proben bei 1000-facher und 2000-facher Vergrößerung zu erhalten. Die Bilder wurden zu Beginn des Experiments, in der Entmineralisierungsphase und nach 14 Tagen Remineralisierungsbehandlung mit Geleebonbons auf Basis einer probiotischen GSE-Nanoemulsion aufgenommen31. Der REM-Scanbereich derselben Probe wurde anschließend mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) (Easyscan2 Flex) untersucht, um die Oberflächentopographie zu bewerten. Die EDAX-Punktanalyse (80 mm2, SDD [Siliziumdriftdetektor]) wurde durchgeführt, um eine qualitative Elementaranalyse derselben Proben zu ermitteln (gemessene Elemente: Ca, P, C, Mg und O). Fünf Punkte pro Probe wurden zufällig ausgewählt (300 μm2 pro Punkt) und die Mittelwerte wurden berechnet35.

Nach der Erzeugung einer künstlichen Schmelzläsion mit glatter Oberfläche (Demineralisierungsverfahren) in den zuvor vorbereiteten Schmelzscheiben wurde die untere Hälfte des 3 × 3 mm großen Fensters von zufällig ausgewählten zwanzig Schmelzscheiben mit Nagellack bedeckt, um als Kontrolle zu dienen20,25. Die Behandlungsdauer dieser Zahnschmelzscheibenläsionen wurde mit probiotischen GSE-Geleebonbons durchgeführt, die zweimal täglich für 5 Minuten aufgelöst wurden, wie bereits erwähnt25,31. Im Anschluss an die Remineralisierungsbehandlung wurden zwanzig Schmelzscheiben 1 Stunde lang mit frisch zubereitetem 0,1 mM Rhodamin B (CI45170) gefärbt, das von Sigma-Aldrich® (Steinheim, Deutschland) bezogen wurde. Die gefärbten Proben wurden sehr gut mit Phosphatpufferlösung gewaschen, bis kein Farbstoff mehr aus der Probe austrat. Alle Proben wurden auf Milchglasobjektträgern mit 80 % Glycerin angebracht und die Kanten des Deckglases abgedeckt25. Die Bilder mit CLSM (CLS Leica TCS SL Umkehrmikroskop M, Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) wurden von der bukkalen Oberfläche aufgenommen. Jedes Bild von beiden Seiten des Mittelpunkts (Aufzeichnungen vor und nach der Behandlung) wurde anhand der okkluso-zervikalen Länge des Zahns bei 10-facher Vergrößerung gemessen, und ein Argonlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm wurde zur Anregung und Anregung verwendet Emissionsbereich von 498–514 nm Wellenlänge45. Die bukkalen Oberflächenbereiche wurden in Mikrometern (μm2) gescannt und die aufgenommenen Bilder (die integrierte Software von Leica TCS SL, Deutschland) wurden auf lineare Fluoreszenztiefe für die untere Hälfte des 3 × 3 mm großen Fensters demineralisiert (Kontrolle) kalibriert sowie die obere Hälfte jeder kariösen Läsion remineralisiert (Behandlungsmittel)36.

Die Daten wurden mithilfe der Kolmogorov-Smirnov- und Shapiro-Wilk-Tests auf Normalität untersucht. Die Daten zeigten eine parametrische (Normal-)Verteilung. Für parametrische Daten wurde eine einfache ANOVA gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test zum Vergleich zwischen den Gruppen in nicht verwandten Stichproben verwendet. Zum Vergleich zwischen den verwandten Proben wurden eine ANOVA mit wiederholten Messungen und ein T-Test mit gepaarten Stichproben verwendet. Das Signifikanzniveau wurde auf P ≤ 0,05 festgelegt. Eine statistische Analyse wurde mit IBM® SPSS® Statistics Version 20 für Windows durchgeführt.

Alle durchgeführten Verfahren dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit den relevanten ethischen Richtlinien und Vorschriften der Helsinki-Erklärung durchgeführt. Die Ethikkommission für medizinische Forschung (MREC), Nationales Forschungszentrum Ägyptens (33 El Bohouth St., Dokki, Gizeh, Ägypten) mit der Referenznummer „19336/2022“, genehmigte alle Versuchsprotokolle. Für die Entnahme isolierter Zähne wurde von allen Teilnehmern eine Einverständniserklärung eingeholt.

Experimentelle Forschung und Feldstudien an Pflanzen, einschließlich der Sammlung von Pflanzenmaterial, erfolgen im Einklang mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften.

Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Bildanalyse in (Abb. 1), die eine Bakterienzelle Lacticaseibacillus rhamnosus (NRRL B-442) (schwarzer Kreis) zeigt, die von einem glatten und homogenen Oberflächenteil eines Stücks Geleebonbon bedeckt ist.

In den Biofilm-Assays (Abb. 2) enthielt die Biofilm-Kontrollgruppe (G1) (129,50 ± 12,37 log10 KBE/ml) A. viscosus und (231,25 ± 13,15 log10 KBE/ml) S. mutans, nachdem nach 21 Tagen Biofilme vorhanden waren aus Speichel initiiert und ohne Behandlung aufgewachsen (G1), außerdem (130,25 ± 9,03 log10 KBE/ml) von A. viscosus und (216,75 ± 11,35 log10 KBE/ml) von S. mutans nach Exposition gegenüber steriler Kochsalzlösung (G2) , während kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Kontrollgruppe (G1) und der Gruppe mit steriler Kochsalzlösung (G2) im Mittelwert der Bakterienzahlen von A. viscosus und S. mutans festgestellt wurde, wobei (P = 0,957) bzw. (P = 0,318). Nach 21-tägiger Behandlung mit 50 µg/2 ml Geleebonbons auf Probiotika-GSE-Nanoemulsionsbasis in der Versuchsgruppe (G3) waren die Bakterienzahlen für A. viscosus im Vergleich zu auf (73,25 ± 10,90 log10 KBE/ml) (P ≤ 0,001) reduziert Kontrollgruppe (G1). Eine Versuchsgruppe wirkte auch am stärksten hemmend auf die Koloniebildung von S. mutans und reduzierte die Biofilmentwicklung auf 74,8 log10 (156,50 ± 22,34 log10 KBE/ml) (P ≤ 0,001). Dementsprechend führte eine einzelne 10-minütige Behandlung täglich über 21 Tage mit Geleebonbons zu einer 68-prozentigen Verringerung der Koloniebildung von S. mutans, wodurch die Biofilmentwicklung verringert wurde.

Ein Balkendiagramm, das die Koloniezahlen von S. mutans und A. viscosus für die 21-tägige Biofilm-Kontrollgruppe ohne Behandlung (G1) und nach Exposition gegenüber steriler Kochsalzlösung (G2) und der probiotischen GSE-Gelee-Versuchsgruppe (G3) darstellt. Der höchste Mittelwert der Verringerung der S. mutans-Koloniezahl wurde in der Versuchsgruppe gefunden (156,50 ± 22,34-log10 KBE/ml) (P ≤ 0,001), während kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Kontrollgruppe (G1) und steriler Kochsalzlösung festgestellt wurde Gruppe (G2) im Mittelwert der Bakterienzahlen von A. viscosus und S. mutans, wobei (P = 0,957) bzw. (P = 0,318).

Das REM-Bild von Schmelzscheiben nach 21 Tagen ohne Behandlung zeigt (Abb. 3A) das Wachstum von Streptococcus mutans (S. mutans) und Actinomyces viscosus (A. viscosus), während (Abb. 3B) das REM-Bild nach 21 Tagen Exposition erhalten wurde zu steriler Kochsalzlösung zeigt, dass S. mutans bis zu einem gewissen Grad dominanter erscheinen könnte als Actino. viskos. Die REM-Bilder deuten darauf hin, dass neu gebildete Kristalle auf der Zahnschmelzoberfläche nach der Verwendung von Geleebonbons auf der Basis einer probiotischen GSE-Nanoemulsion (Abb. 3C) und dem Einfangen von S. mutans in Geleebonbons (Abb. 3D) angezeigt und deutlich visualisiert wurden (Abb . 3E,F) bei Vergrößerungen (4000 ×), bzw. (16.000 ×). Die TEM-Bilder zeigen eine deutlich veränderte morphologische Struktur von S. mutans (Abb. 4F) im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 4D) und der Gruppe mit steriler Kochsalzlösung (Abb. 4E). Im Fall von A. Viscous trat eine geringfügige Veränderung an der Außenseite der Zellen auf (Abb. 4C), nachdem sie 21 Tage lang Geleebonbons ausgesetzt war, mit selten sichtbaren Veränderungen an der Zelloberfläche (Abb. 4A, B) der Kontrolle und des Sterilguts Salzgruppen bzw.

REM-Bilder von Schmelzscheiben zeigen: (A) 21-tägiges Wachstum von S. mutans (blauer Pfeil) und A. viscosus (roter Pfeil) ohne Behandlung. (B) Biofilmwachstum (gelber Kreis) trat nach 21-tägiger Exposition gegenüber steriler Kochsalzlösung für 10 Minuten zweimal täglich auf. (C) SEM-Bild der Kristalle (grauer Pfeil), die sich auf der Zahnschmelzoberfläche nach der Verwendung von Geleebonbons auf Basis einer probiotischen GSE-Nanoemulsion gebildet haben, und (D) zeigt die Abdeckung von Bakterienzellen durch Geleebonbons (orangefarbener Kreis). In (E,F) zeigte sich nach einer vergrößerten mikroskopischen Aufnahme von (D) (orangefarbener Kreis) bei Vergrößerung (× 4000) (E) das Vorhandensein einer Kolonie kokkenähnlicher Bakterien (weißer Kreis). Bei einer Vergrößerung von (D) (orangefarbener Kreis) bei (× 16.000) (F) war deutlich zu erkennen, dass S. mutans (dunkelorangefarbene Pfeile) mit Geleebonbons bedeckt war und sich bakterienähnliche Bakterien (L. rhamnosus) anhefteten (grüne Pfeile). ) auf seiner Oberfläche.

TEM-Bilder zeigen eine signifikante Veränderung bei Streptococcus mutans-Zellen (F) (rote Pfeile), wobei eine geringfügige Veränderung bei Actinomyces viscosus außerhalb der Zellen auftrat (C) (blauer Pfeil) nach 21-tägiger Exposition gegenüber Geleebonbons auf Basis einer probiotischen GSE-Nanoemulsion. Bei Biofilmwachstum ohne Behandlung (A,D) und nach Einwirkung von steriler Kochsalzlösung (B,E) sind selten Veränderungen an den Zelloberflächen sichtbar.

In der Remineralisierungsanalyse zeigt Abb. 5 die Daten für VHN-Werte für dieselben Proben zu Studienbeginn, vor der Demineralisierung und nach 7- und 15-tägiger Exposition gegenüber Geleebonbons auf der Basis einer probiotischen GSE-Nanoemulsion. VHN unterschied sich signifikant zwischen den Stadien und den Behandlungszeiten (P < 0,0001). Die VHN-Werte sanken nach der Demineralisierung erheblich, wie im Liniendiagramm in Abb. 5 dargestellt, mit einem statistisch signifikanten allmählichen Anstieg der VHN-Werte an den Tagen 7 und 15 der Remineralisierung. Die Ergebnisse des AFM in Abb. 6 haben gezeigt, dass die von der AFM-Sonde gescannte Topographiestruktur mit den dynamischen Veränderungen der Schmelzoberfläche derselben Probe zusammenhängen könnte. Die erhaltenen Ergebnisse in (Abb. 6B) zeigten, dass die Rückstreuintensität auf der Zahnoberfläche nach der Demineralisierung stärker wurde und nach 14 Tagen Remineralisierungsbehandlung mit Geleebonbons auf Basis einer probiotischen GSE-Nanoemulsion allmählich abnahm, wie in (Abb. 6C) gezeigt. . Um die in (Abb. 6A–C) dargestellten AFM-Ergebnisse zu validieren, wurden die Unterschiede zwischen gesunden, demineralisierten und remineralisierten Zähnen mittels REM untersucht. Abbildung 6A1, C1 zeigt die REM-Bilder der gesunden und remineralisierten Schmelzoberflächen, die bei 2000-facher bzw. 3000-facher Vergrößerung aufgenommen wurden.

Das Liniendiagramm liefert die Daten für den Mittelwert der gemessenen Vickers-Härte für die gesunden Zahnschmelzscheiben zu Studienbeginn, nach Demineralisierung und nach 7 und 14 Tagen Remineralisierungsbehandlung mit Geleebonbons auf Basis einer probiotischen GSE-Nanoemulsion. VHN unterschied sich signifikant zwischen den Stadien und den Behandlungszeiten (P < 0,0001). Während des Behandlungszeitraums vom 7. bis zum 14. Tag kam es zu einem statistisch hochsignifikanten Anstieg des Mittelwerts von VHN bei P < 0,01.

(A–C) Linienprofile von AFM für die Oberflächenschmelzscheiben, die REM-Bilder von (A1, B1, C1) darstellen und jeweils die Fähigkeit von AFM zur Bewertung der Oberflächentopographie zeigen. Entsprechende REM-Bilder derselben Probe. Daten, die vor Beginn des Experiments (A, A1), im Demineralisierungsstadium (B, B1) erhoben wurden und die durch die gelben Pfeile gekennzeichneten hexagonalen Strukturen im Zusammenhang mit der Freilegung von Schmelzstäben und nach 14-tägiger Demineralisierungsbehandlung mit probiotischem GSE-Gelee zeigen Süßigkeiten (C,C1).

Zeigen Sie in Abb. 6B1 die REM-Bilder des demineralisierten Zahns an, die bei 3000-facher Vergrößerung erhalten wurden. Im Gegensatz zu den in (Abb. 6A1, C1) dargestellten Ergebnissen enthält die Schmelzoberfläche nach dem Ätzen die durch die gelben Pfeile in Abb. 6B1 gekennzeichneten sechseckigen Strukturen, die mit der Freilegung von Schmelzstäben zusammenhängen könnten. Die Beobachtungen der anorganischen Verbindungen auf der Schmelzoberfläche, die mittels EDX in Form von Diagrammen durchgeführt wurden, sind in (Abb. 7A–C) und entsprechenden Einträgen in Tabelle 1A–C für die Gewichtsprozente dieser Verbindungen (Ca, P, C, O und Mg) in Oberflächenschmelzproben in drei Stadien (gesund, nach Demineralisierung und nach 14 Tagen Remineralisierungsbehandlung mit Geleebonbons auf Probiotika-GSE-Nanoemulsionsbasis). Der Oberflächengewichtsprozentsatz von Ca, P, C, O und Mg wurde durch die Entmineralisierungszeit und die Behandlung erheblich beeinflusst, wie in (Abb. 7B und Tabelle 1B) gezeigt, und zeigt auch einen nachweisbaren Rückgang des Gewichtsprozentsatzes beider Ca (15,36 Gewichtsprozent). ) und P (11,12 Gew.-%) nach der Entmineralisierungsstufe im Vergleich zur Schallstufe Ca (23,38 Gew.-%) und P (15,38 Gew.-%). Der Oberflächengewichtsprozentsatz von Ca wurde durch die Behandlung erheblich beeinflusst, da die Proben unabhängig vom Entmineralisierungsstadium einen hohen Oberflächenkalziumgewichtsprozentsatz (29,75 Gew.-%) erhielten, wie in (Abb. 7C und Tabelle 1C) gezeigt.

Energiedispersive Röntgenspektren, die auf gesundem Zahnschmelz, nach demineralisierter Läsion und nach remineralisierter Läsion gesammelt wurden, wurden verglichen. Die Röntgenspektren wurden mit einer Beschleunigungsspannung von 15 kV aufgenommen.

EDX erkannte im Entmineralisierungsstadium stärkere Kohlenstoffsignale (12,41 Gew.-%) im Gegensatz zum Schallstadium (C, 3,83 Gew.-%) und der Kohlenstoffgewichtsprozentsatz nahm in der nach der Behandlung an der Schmelzoberfläche gebildeten mineralisierten Schicht allmählich ab (C, 9,29 Gew.-%). ). Auch die Mengen an anorganischen Verbindungen, Sauerstoff und der Magnesiumgehalt auf der Zahnschmelzoberfläche stiegen nach der Entmineralisierung offensichtlich an (O, 59,33 Gew.-% und Mg, 1,77 Gew.-%) und sanken nach der Behandlung deutlich (O, 44,97 Gew.-% und Mg, 0,57 Gew.-%). %). Die induzierten kariösen Läsionstiefen wurden gemäß CLSM Abb. 8 durch Messung von der Schmelzoberfläche bis zur tieferen Zone der Läsion beurteilt. Von jedem Bild, das sowohl in der demineralisierten als auch in der remineralisierten Zone der Läsion aufgenommen wurde, wurden durchschnittlich zehn Messungen vorgenommen ( 3 × 3 mm großes Fenster jeder Probe. Das aufgenommene Bild zeigt das Diagramm der Fluoreszenzintensität, das in (Abb. 8b) angezeigt wurde, während das Bild die Längenmessungen zeigt (Abb. 8a). Beim Vergleich zwischen demineralisierten und remineralisierten Zähnen war eine signifikante Remineralisierung mit einer Verringerung der Läsionstiefe für die obere Hälfte der remineralisierten Zone der Fensterprobe nach sieben Tagen Behandlung mit Geleebonbons auf der Basis einer probiotischen GSE-Nanoemulsion erkennbar. Außerdem wurde das Ausmaß der Penetration des Farbstoffs 0,01 mM Rhodamin B als Fluoreszenz in den Proben unter Argonlaserkalibrierung beobachtet und mit der integrierten Software [Leica TCS SL, Deutschland] aufgezeichnet. Die Ergebnisse zeigen, dass bei Verwendung einer 0,1 mM Lösung des Rhodamin-B-Farbstoffs die Läsionsfläche gut mit dem Mineralverlust korrelierte. Allerdings stellte die durchschnittliche Läsionsfluoreszenz den Mineralverlust am besten dar, wie in (Abb. 8a) gezeigt, und der höchste Wert der Läsionstiefe nach der Demineralisierung betrug 34,06 ± 7,81 μm mit einem Anstieg der Fluoreszenzintensität, wie in (Abb. 8b) zu sehen ist. Im Gegensatz dazu betrug der höchste Läsionstiefenwert der Remineralisierung 28,76 ± 3,46 μm, was einer Abnahme der Fluoreszenzintensität entspricht. Daher waren die Werte signifikant [P < 0,001] und die Remineralisierungswerte waren niedriger als die Demineralisierungen, die unter CLSM erhalten wurden (Abb. 8).

(a) Darstellung der linearen Tiefe der Läsion in μm, gesehen durch ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop und (b) Darstellung eines kalibrierten Bildes für Diagramme der Fluoreszenzintensität sowohl entlang demineralisierter als auch remineralisierter Bereiche.

Zahnkaries entsteht durch eine Störung der Biomineralisierung des Zahnschmelzes. Eine Demineralisierung wird verursacht, wenn der pH-Wert des oralen Biofilms durch einen Säureangriff durch in Nahrungsmitteln oder Getränken aufgenommene Nahrungssäure und durch einen mikrobiellen Angriff durch bestimmte Bakterienstämme, die in den oralen Biofilmen auf der Zahnschmelzoberfläche vorhanden sind, unter 5,5 fällt37. Die meisten synthetischen Zucker werden nicht oder nur geringfügig durch orale Bakterien fermentiert, sodass sie den pH-Wert von 38 nicht mehr senken. Darüber hinaus führt Kaugummi zu einer verbesserten Remineralisierung des Zahnschmelzes, indem der Kalzium- und Phosphatspiegel in der Mundhöhle durch das erhöhte Volumen des angeregten Speichels während des Kauens erhöht wird, mit der gleichzeitigen Fähigkeit, fermentierbare Kohlenhydrate und Säuren von den Zahnoberflächen zu entfernen39,40.

Eine symbiotische Beziehung und eine vielfältige Zusammensetzung des oralen Mikrobioms sind die Hauptschlüssel für die Mundgesundheit, auch wenn die genaue Zusammensetzung dessen, was vorläufig als „gesundes orales Mikrobiom“ bezeichnet wird, nicht immer bekannt ist. Die Eliminierung spezifischer Krankheitserreger könnte auf eine Dysbiose des oralen Mikrobioms durch eine Verschiebung der Mikrobiomzusammensetzung auf einen weniger vielfältigen Weg zurückzuführen sein, und diese Dynamik bietet Chancen für orale Erkrankungen59. In unseren mikrobiologischen Tests könnte die auf einer Nanoemulsion basierende Geleebonbons auf Probiotika-Traubenkernextrakt (GSE) einen bereits gebildeten kariogenen Biofilm nach 21 Tagen besser bekämpfen, was zu einer Verringerung der Bakterienzahl bei A. viscosus und einer signifikanten Abnahme von 68 % bei S. führt. Mutans-Koloniebildung reduziert die Biofilmentwicklung. Daher stützt unsere Studie die Schlussfolgerung, dass der allmähliche Rückgang spezifischer bakterieller Krankheitserreger aus der Mundhöhle durch Kaugummi am vorteilhaftesten für überraschende ökologische Veränderungen ist, die die Beziehung zwischen dem oralen Mikrobiom und dem Wirt verändern könnten, die Homöostase fördern und somit dazu beitragen Das orale Mikrobiom bei Gesundheit41.

Der Einsatz probiotischer Milchsäurebakterien (LAB), insbesondere Laktobazillen, als natürliche Barriere gegen Krankheitserreger könnte aufgrund ihrer Produktion antimikrobieller Metaboliten sehr effizient sein42. Es ist jedoch wichtig, ein solches antimikrobielles Produkt in einer natürlichen, lebensmittelähnlichen Form anzubieten, die für den Verbraucher am besten geeignet ist. Nach Angaben der WHO (Weltgesundheitsorganisation, 2014)43 entwickelt sich die antibakterielle Resistenz gegen bakterielle Krankheitserreger zu einem erheblichen Problem der öffentlichen Gesundheit. In dieser Hinsicht stellte unsere Studie Kombinationen antimikrobieller Verbindungen (Probiotikum und Traubenkernextrakt (GSE)-Nanoemulsion) in Geleebonbons dar, die die Wirksamkeit des antimikrobiellen Produkts erhöhen und eine Reduzierung der Dosis jeder Verbindung ermöglichen könnten. In ähnlicher Weise könnte Synergismus bei antimikrobiellen Mitteln genutzt werden, um die Entstehung der Resistenz spezifischer pathogener Bakterienstämme in vivo zu verzögern44.

Eine glatte und homogene Oberfläche von Geleebonbons unter dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM), wie in (Abb. 1) dargestellt. Die Zugabe von Ölsäure zu den inneren Bestandteilen der entwickelten Gummibonbonformel könnte zu einer Veränderung der morphologischen Oberfläche führen. Darüber hinaus wird vermutet, dass die Verfügbarkeit bestimmter Fettsäuren in einer entwickelten Formel ein Faktor ist, der zur Aufrechterhaltung der probiotischen Bakterienzellwandmorphologie im Geleebonbon und zum Schutz vor sauren Bedingungen in der Mundhöhle beiträgt45.

Die morphologischen Aspekte der mikrobiellen Besiedlung natürlicher Zahnoberflächen wurden sowohl mit rasterelektronenmikroskopischen (REM) als auch mit Transmissionselektronenmikroskopischen (TEM) Analysen untersucht. In der vorliegenden Studie wurde die Beschichtung von S. mutans in Geleebonbons auf Probiotika-GSE-Nanoemulsionsbasis unter REM deutlich sichtbar gemacht. Frühere Beobachtungen zeigten, dass Kaugummi zur Wiederherstellung der Mundgesundheit beiträgt und lose gebundene Mundbakterien von den Mundoberflächen entfernt21,39. Daher kann unser experimenteller Kaugummi krankheitserregende Bakterien hemmen und aus der Mundhöhle eliminieren. Die in der aktuellen Studie präsentierten TEM-Aufnahmen stützen die Schlussfolgerung, dass bei A. viscosus nach 21-tägiger Exposition gegenüber Geleebonbons eine deutlich veränderte morphologische Struktur von S. mutans mit einer geringfügigen Veränderung an der Außenseite der Zellen auftrat. Vor der TEM-Auswertung müssen die Proben jedoch große Verarbeitungsschritte durchlaufen, und die Denaturierung von Proteinen während der Fixierung und Dehydrierung der Proben kann einen Kondensationseffekt verursachen, sodass eine Änderung des ultrastrukturellen morphologischen Erscheinungsbilds der Bakterienoberfläche durch diese möglicherweise auftretenden Artefakte nicht beeinträchtigt wird23. In der vorliegenden Studie zur Untermauerung der mikrobiologischen Schlussfolgerung wurde die antimikrobielle Aktivität von Traubenkernextrakt (GSE) auf die in der Nanoemulsion beobachtete Verfügbarkeit von Phenolen zurückgeführt46,47,48. In Übereinstimmung mit den vorangegangenen Ergebnissen waren die primär aktiven Polyphenolverbindungen Catechin, Chlorogensäure und Methylgallat, die eine antimikrobielle Wirkung haben. Darüber hinaus stimmten unsere Ergebnisse mit der vorherigen Studie überein und zeigten, dass Probiotika kariogenen Arten wie S. mutans stark entgegenwirken können49. Darüber hinaus wurden die von probiotischen Laktobazillen produzierten Säuren untersucht, die einen unmittelbaren Einfluss auf das Wachstum von S. mutans haben21,50.

Die vorhandenen REM-Bilder zeigten neu gebildete Kristalle auf der Zahnschmelzoberfläche nach der Verwendung von Geleebonbons auf Nanoemulsionsbasis mit probiotischem Traubenkernextrakt (GSE). Xie et al. schlugen vor, dass GSE zur Ablagerung von Mineralien in der oberflächlichen Schicht der Läsion beitragen sollte51. Frühere Arbeiten berichteten, dass eine hohe Kalziumkonzentration in Traubenkernen (55,74 %) bei einer geringeren Phosphorkonzentration (15,34 %) erzielt wurde11. Dementsprechend könnte es sich bei diesen neu gebildeten Kristallen um Calciumphosphat handeln, das in einer löslichen kristallinen Phase namens Bruschit vorliegt und zur Verbesserung der Remineralisierung von Läsionen unter der Oberfläche des Zahnschmelzes beiträgt52,53.

Die aktuelle Studie zeigte einen starken Zusammenhang zwischen der Härte der Schmelzoberfläche und ihrem chemischen Gehalt. Regionen mit einer höheren Konzentration an Kalzium und Phosphor zeigten nach der Behandlung mit Geleebonbons auf Probiotika-GSE-Nanoemulsionsbasis die höchsten Vickers-Härtewerte (VHN). Regionen mit höheren Natrium- und Magnesiumkonzentrationen zeigten jedoch nach der Entmineralisierungsphase einen alternativen Trend. Die vorliegenden Ergebnisse wurden von mehreren anderen nachgewiesen54,55, die berichteten, dass die niedrigeren Mikrohärtewerte mit einer gleichzeitigen Abnahme des Kalzium- und Phosphorgehalts einhergingen. Die durch EDX erhaltenen Ergebnisse zeigten jedoch einen nachweisbaren Rückgang der Gewichtsprozente von Ca und P nach der Entmineralisierung, der sich auf die Ultrastruktur des Zahnschmelzes auswirken könnte, indem die Zwischenräume zwischen den Prismen vergrößert und einzelne Kristallite durch deren Auflösung umgewandelt werden56. Darüber hinaus ist die Remineralisierung entmineralisierter Kristallite unter Verwendung von Geleebonbons nicht gleichmäßig, da sich Ionen in zentralen Defekten und an der Kristallperipherie ablagern, wodurch die Unregelmäßigkeit der Kristallite weiter zunimmt56,57. Dadurch entstehen Regionen unterschiedlicher Porosität mit ungleichmäßiger Größe und räumlicher Verteilung.

Darüber hinaus könnten die durch AFM erhaltenen Ergebnisse mit den dynamischen Veränderungen der Zahnschmelzoberfläche in Zusammenhang stehen, da die rückgestreute Intensität auf der Zahnoberfläche nach der Demineralisierung stärker wurde und nach einer 14-tägigen Remineralisierungsbehandlung mit Geleebonbons allmählich abnahm. Früher wurde gezeigt, dass die durch die Säure verursachte Entmineralisierung das Auftreten von Schmelzstäbchen auf der geätzten Schmelzoberfläche hervorrief58. Unsere Studie zeigte jedoch die verbesserte Rückstreuintensität an der Schmelzoberfläche, die wahrscheinlich mit dem Vorhandensein dieser Stäbchen zusammenhängt. Daher stimmen diese Effekte mit den Daten einer früheren Studie überein.

Die aktuelle Studie validierte die AFM-Ergebnisse durch SEM. Die REM-Bildergebnisse zeigten die Schmelzoberfläche nach dem Ätzen, die sechseckige Strukturen enthielt, die mit der Freilegung von Schmelzstäben zusammenhängen könnten. Zuvor stützten Arbeiten die Idee, dass diese Strukturen Schmelzstäbe oder -prismen darstellen, die hexagonale Hydroxylapatitkristalle enthalten58,59. Daher zeigten die REM-Bilder, dass die Demineralisierung des Zahns zur Auflösung von oberflächlichem Calciumhydroxylapatit führte, wodurch die Zahnschmelzstäbe freigelegt wurden und die Rückstreuintensität von der Zahnoberfläche verstärkt wurde.

Die induzierten kariösen Läsionstiefen wurden unter CLSM untersucht, indem von der Schmelzoberfläche bis zur tieferen Zone der Läsion gemessen wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass der höchste Läsionstiefenwert der Remineralisierung 28,76 ± 3,46 μm betrug, was einer Abnahme der Fluoreszenzintensität entspricht. Bei Verwendung einer 0,1 mM Lösung des Rhodamin-B-Farbstoffs korrelierte die Läsionsfläche gut mit dem Mineralverlust60,61. Wie bereits in der vorliegenden Studie erwähnt, könnten Kalzium und Phosphor in Traubenkernen in einer löslichen kristallinen Phase namens Bruschit vorliegen und die Remineralisierung von Läsionen unter der Oberfläche des Zahnschmelzes fördern52,53. Die durchschnittliche Läsionsfluoreszenz, die den Mineralverlust am besten darstellt, beruht jedoch auf ihrer Vermutung, dass Rhodamin B in die Hohlräume und Poren eindringt, die während der Demineralisierung des Zahns entstehen, was ein beliebter Ansatz zur Beurteilung der Doppelbrechung mittels CLSM25 ist.

Auf dem Markt ist eine Vielzahl neuer antikariogener und remineralisierender Wirkstoffe erhältlich. Daher ist es wichtig, die Vorteile und Wirksamkeit dieser Produkte zu verstehen, bevor man ihren Einsatz in der klinischen Praxis empfiehlt. Die Vorteile unserer Studie sind die Einbeziehung von Geleebonbons auf Basis einer probiotischen GSE-Nanoemulsion gegenüber einer probiotischen Suspension, einschließlich der Möglichkeit, sie als topisches Mittel anzuwenden, der Möglichkeit der Lagerung und der längeren Exposition mikrobieller Zellen in der Mundhöhle. Die klinische Bedeutung probiotischer Gelee-Bonbons. Ergänzt mit Nanoemulsion-Traubenkernextrakt (GSE), könnte seine Bedeutung weiterhin an Bedeutung gewinnen, so wie es in der Vergangenheit die Bedeutung von Fluorid für das Remineralisierungspotenzial und die signifikante Kariesreduzierung war. Daher hat die praktische Anwendung der entwickelten Formel Probiotic-GSE Jelly Candy einen potenziellen therapeutischen Wert und kann bei der routinemäßigen Anwendung eine hohe Kosteneffizienz aufweisen. Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse können jedoch als Leitfaden für weitere klinische Untersuchungen dienen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in Geleebonbons imprägnierte Nanoemulsion aus Traubenkernextrakt und dem probiotischen Stamm Lacticaseibacillus rhamnosus (NRRL B-442) innerhalb der Grenzen dieser experimentellen Studie sowohl antikariogen als auch remineralisierend wirken konnte, was auf eine mögliche Verwendung bei der Kariesprävention schließen lässt und Reduzierung. Darüber hinaus wird eine klinische Langzeitstudie zur Feststellung der Wirksamkeit empfohlen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde vom National Research Center (NRC), Ägypten, unterstützt. Projektnummer: 12060205.

Open-Access-Finanzierung durch die Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) in Zusammenarbeit mit der Egyptian Knowledge Bank (EKB). Diese Arbeit wurde vom National Research Center (NRC), Ägypten, unterstützt. Projektnummer: 12060205.

Abteilung für restaurative und zahnmedizinische Materialien, Orale und zahnmedizinische Forschungsinstitute, Nationales Forschungszentrum, 33 El Bohouth St., Dokki, Gizeh, 12622, Ägypten

Hanaa M. Elgamily

Milchabteilung, Lebensmittelindustrie und Ernährungsforschungsinstitut, Nationales Forschungszentrum, 33 El Bohouth St., Dokki, Gizeh, 12622, Ägypten

Samah M. El-Sayed & Hoda S. El-Sayed

Abteilung für Verpackungsmaterialien, Nationales Forschungszentrum, 33 El Bohouth St., Dokki, Gizeh, 12622, Ägypten

Ahmed M. Youssef

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HME, SME, HSE und AMY haben die Studie konzipiert. HME plante die Experimente. HSE und AMY führten die Experimente durch und analysierten die Daten. HME, SME, HSE und AMY haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren lasen das endgültige Manuskript und stimmten zu, für alle Aspekte der Arbeit verantwortlich zu sein.

Korrespondenz mit Hanaa M. Elgamily.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Elgamily, HM, El-Sayed, SM, El-Sayed, HS et al. Laborbewertung der Anti-Plaque- und Remineralisierungswirksamkeit von zuckerfreien probiotischen Geleebonbons, ergänzt mit natürlichem nanopräbiotischem Zusatzstoff. Sci Rep 13, 10977 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37645-5

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Eingegangen: 31. Dezember 2022

Angenommen: 25. Juni 2023

Veröffentlicht: 06. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37645-5

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